듀얼 시린지펌프를 이용한 비손상 세포외 소포 분리법

2.1 상업용 연동펌프 와 듀얼 시린지펌프의 특성

1930년대, 마이클 드베이키(Michael E. DeBakey)가 혈액 이송을 위해 롤러펌프(roller pump)를 개발한 것을 시작으로, 이후 이 기술이 고도화되어 연동펌프 형태로 발전해 다양한 의료 및 제약 분야에서 활용되고 있다.

연동펌프는 모터 회전수(RPM)를 제어함으로써 로터가 회전하고, 롤러가 튜빙 내부의 시료를 밀어내는 방식으로 작동한다.

시료는 튜빙 내부에서만 이동하므로 외부 오염 위험이 적고, 교차오염 방지에 탁월하며 유지보수도 간편하다.

반면, 시린지펌프는 더욱 정밀한 주입이 필요한 약물 투여나 시료 이송에 주로 사용된다. 이는 회전운동으로 작동하는 연동펌프와 달리, 직선 운동을 통해 시료를 주입⋅흡입하는 구조로 설계되어 있다.

2.2 상업용 연동펌프 구성

본 실험에서 사용된 상업용 연동펌프의 구성은 Fig. 1에 제시되어 있다. 일반적으로 연동펌프는 캠축에 장착된 튜빙의 세 지점을 순차적으로 압착하여 시료를 이송하는 원리를 기반으로 하며, 병렬식 모듈 추가를 통해 단일 캠축으로 여러 튜빙 및 대응 필터를 동시에 작동시킬 수 있다.

Fig. 1

상업용 연동펌프 및 구동 원리

Fig. 2

듀얼 시린지펌프의 구성도 및 작동 원리

Fig. 3

듀얼 시린지펌프의 체크밸브 원리

Fig. 4

시린지 전환시간 조절에 따른 유량 변화

높은 유량으로 가동할 경우 맥동(Pulsation)이 증가해 진동 문제가 야기될 수 있으므로, 본 연구에서는 맥동을 최소화할 수 있는 10∼50 ml/min 범위의 유량 설정값을 선정하여 실험에 적용하였다.

Table 1

상업용 연동펌프와 듀얼 시린지펌프의 특성

2.3 듀얼 시린지펌프의 구성

본 연구에서 개발된 듀얼 시린지펌프는 두 가지 단계로 시료를 순환시킨다. [6]

첫 번째 단계에서는 1번 시린지가 시료를 튜빙으로 밀어내고, 동시에 2번 시린지가 시료를 흡입한다. 두 번째 단계에서는 1번 시린지가 다시 시료를 흡입하고, 가득 찬 2번 시린지가 시료를 밀어낸다.

이러한 원리는 Fig. 5에서 확인할 수 있다. 핵심 원리는 두 개의 시린지가 교대로 가상의 단방향 필터 주입부에 시료를 연속적으로 주입하는 것인데, 이 과정에서 체크밸브의 역할이 매우 중요하다.

Fig. 5

순수한 HCT116 세포 배양액의 입도 분포

2.4 듀얼 시린지펌프의 체크밸브

Fig. 6에서처럼, 각 시린지에는 두 개의 체크밸브가 연결되어 있으며, 각 체크밸브는 흡입과 주입 역할을 반대로 수행하도록 배치되어 있다.

Fig. 6

연동펌프 1시간 작동 후 세포 배양액의 입도 분포

두 개의 시린지는 하나의 체크밸브를 통해 시료를 흡입하고, 다른 하나의 체크밸브를 통해 주입만 가능하도록 구성되어 있다. 체크밸브는 폴리스타이렌(Polypropylene)과 서스(SUS304) 소재로 구성되어 높은 바이오 안정성을 갖고 있다.

1번 시린지와 2번 시린지는 주입 또는 흡입이 실행된 직후 전환시간이 발생한다. 이 전환시간은 시스템의 유동 특성을 결정짓는 중요한 요소로 작용한다.

전환시간은 소프트웨어를 통해 조작이 가능하며, 전환시간이 길어지면 맥동(pulsation)의 주기가 길어지고 유량의 변화가 상대적으로 불규칙해질 수 있다. 반면, 전환시간을 짧게 설정하면 맥동의 영향을 최소화하여 선형적인 유량(linear flow)을 얻을 수 있다.

Fig. 7에서처럼 전환시간이 0초로 설정되었을 경우, 연속적인 흐름이 생성되며 이는 연동펌프와 유사한 특성을 보인다. 반대로, 전환시간이 길어질수록 유량 그래프에서 불규칙한 맥동이 나타나고, 이를 통해 유동 패턴의 조절이 가능하다. 소프트웨어 기반의 전환시간 조절은 유동 환경을 정밀하게 제어할 수 있도록 하며, 특정 응용 분야에서 요구되는 유량 특성을 달성하는 데 매우 유용하게 활용된다.

Fig. 7

연동펌프 2시간 작동 후 세포 배양액의 입도 분포

본 실험에서는 연동펌프와의 비교를 위해 전환시간이 가장 짧은 0초 조건으로 시료를 순환시켰다.

이로 인해 선형적인 유량 특성이 확인되었으며, 전환시간이 0.95초 또는 1.25초로 길어질 경우 맥동의 주기가 길어지면서 전환시간이 시스템의 동작에 미치는 영향을 그래프를 통해 명확히 관찰할 수 있다. [7]

3.1 상업용 연동펌프의 입도 변화 분석

세포외 소포와 같은 입자의 여과 성능을 분석하기 위해 HCT116(대장암 세포주) 배양액과 이에 대한 입도분석이 수행되었다. D10, D50, D90 등 분포 크기를 알 수 있는 핵심 지표인데, D10의 경우 크기순으로 10%의 입자, D50은 50%, D90은 90%의 입자 크기이다. 이 변화들을 관찰함으로써 시료에 입도 변화를 수치적으로 분석이 가능하다.

실험은 시료를 초기 보관 용기에서 펌프를 통해 다시 보관 용기로 순환시키는 방식이며 1시간, 2시간 총 2가지 조건으로 진행하였다.

초기 HCT116 세포 배양액의 입도 분포는 Fig. 2에 나타나 있으며, 입자 농도는 7.65×108 ea/ml 수준이고, D50은 116 nm, D90은 192.3 nm로 확인되었다. [5]

상업용 연동펌프의 순환 펌핑 후 입도 변화를 관찰하기 위해 HCT116 세포 배양액 50 ml를 30 ml/min의 유속으로 1시간 동안 실험을 진행하였다. Fig. 3에 나타난 것처럼, D10, D50, D90 값에서 유의미한 변화가 관찰되었으며, 각각 14.7 nm, 28.5 nm, 33.4 nm 증가하였다.

이와 같은 방식으로 2시간 동안 실험을 진행한 결과, 초기 순수 세포 배양액과 비교했을 때 Fig. 4와 같이 입도 변화가 더욱 크게 발생하였다. D10, D50, D90 값은 각각 14.4 nm, 32.9 nm, 45.4 nm 증가한 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 장시간 연동펌프 사용이 시료 내 입도 분포를 넓히는 직접적인 원인임을 보여준다. 반면, 순환 펌핑 없이 방치한 대조군은 순수한 세포 배양액과 비교하여 약 2 % 정도의 편차만 발생하였다.

Table 2에 나타난 입도 수치 변화를 근거로, 연동펌프를 이용한 시료 압착 방식의 유체 순환 운송이 배양액 내 미세 입자 응집과 시료 변형을 야기함을 명확히 확인할 수 있었다.

Table 2

연동펌프로 순환된 세포배양액의 나노입자추적 분석 결과

3.2 듀얼 시린지펌프의 입도 변화 분석

듀얼 시린지펌프를 이용해 1시간 동안 순환시킨 세포 배양액의 입도 분포는 Fig. 8에서 확인할 수 있다. 표3 은 나노입자추적 분석을 통해 순환 전후의 입도 분포 변화를 정량적으로 보여준다.

Fig. 8

듀얼 시린지펌프 1시간 작동 후 세포 배양액의 입도 분포

이 실험에서는 연동펌프와 마찬가지로 Mean, Mode, SD, D10, D50, D90의 데이터를 측정하였다.

연동펌프와 비교했을 때, 듀얼 시린지펌프는 D10이 21.1 nm, D50이 26.4 nm, D90이 23.4 nm로, 연동펌프 대비 낮은 입도 변화를 보였다. 이는 듀얼 시린지펌프가 초기 세포 배양액에 비해 D10에서 -6.4 nm, D50에서 2.1 nm, D90에서 10.0 nm의 변화를 나타내며, 입자 크기 증가를 효과적으로 예방했음을 보여준다. 이러한 결과는 듀얼 시린지펌프가 시료에 압착과 맥동 없이 일정한 압력으로 소포체를 운송할 수 있는 특성에 기인한 것으로 해석된다.

초기 세포 배양액과 비교했을 때, 듀얼 시린지펌프의 입도 변화는 미미한 수준에 그쳤다. D10은 -7.4%, D50은 1.8%, D90은 5.2%의 변화만 관찰되었으며, 이는 소포체의 크기 변화가 거의 발생하지 않았음을 시사한다. 특히 D50과 D90에서의 감소폭이 적었다는 점은 듀얼 시린지펌프가 튜빙에 외력을 거의 발생시키지 않아 소포체 크기를 안정적으로 유지하는 데 뛰어난 성능을 보였음을 보여준다.

반면, 연동펌프는 구조적 특성상 유체에 높은 전단응력(Shear Stress)을 발생시키며, 이로 인해 입자 크기 변화가 상대적으로 크게 나타났다. 듀얼 시린지펌프는 이러한 전단응력을 효과적으로 낮추어, 입자 크기 변화가 제한적이었음을 확인할 수 있다. [8]

이번 1시간 순환 실험 결과는 듀얼 시린지펌프가 세포 배양액의 입도 분포를 안정적으로 유지하며, 연동펌프와 비교했을 때 입자 손상이 적다는 점을 명확히 보여주었다.

Fig. 9에서 보이는 것처럼, 가시적으로 듀얼 시린지펌프를 이용해 2시간 동안 순환시킨 시료의 입도 분포를 동시간 순환시킨 연동펌프와 비교한 결과, 1시간 순환 실험과 마찬가지로 듀얼 시린지펌프가 입자 크기 변화를 최소화하는 데 더 효과적인 것으로 확인되었다. 연동펌프 대비 듀얼 시린지펌프는 세포 배양액의 순환 후 입도 변화에서 D10은 19.1 nm, D50은 32.9 nm, D90은 24.1 nm 낮게 측정되었다. 이는 시간이 지날수록 연동펌프가 높은 전단응력을 발생시켜 소포체 크기가 증가하는 경향이 나타났기 때문으로 해석된다. 초기 세포 배양액과 듀얼 시린지펌프를 2시간 순환한 결과를 비교해 보면, D10은 4.7 nm 감소하였고, D50은 변화가 없었으며, D90은 21.3 nm로 약간의 변화만 관찰되었다.

Fig. 9

듀얼 시린지펌프 2시간 작동 후 세포 배양액의 입도 분포

연동펌프를 이용한 경우 입자 크기 변화율은 상대적으로 높게 나타났는데, D10은 초기 세포 배양액에 비해 16.7% 증가하였고, D50은 28.4%, D90은 23.6% 증가하였다. 반면, 듀얼 시린지펌프를 사용한 경우 입자 크기 변화율은 상대적으로 적었으며, D10은 초기 세포 배양액에 비해 5.5% 감소하였고, D50에서는 변화가 없었으며, D90은 11.1% 증가하여 D90에서만 약간의 변화가 관찰되었다. 이러한 결과는 듀얼 시린지펌프가 연동펌프에 비해 장시간 순환에서도 전단응력을 낮게 유지하여 소포체 크기 감소를 효과적으로 예방함을 보여준다.

이러한 2시간 순환 실험의 결과, 듀얼 시린지펌프는 연동펌프와 비교하여 세포 배양액의 물리적 안정성을 단시간과 장시간 모두 유지하는 데 효과적이며, 소포체의 입도 변화를 최소화하는 데 적합한 여과 공정임이 확인되었다.

앞선 수치의 변화는 Table 3에서 상세히 정리되었다.

Table 3

듀얼 시린지펌프로 순환된 세포배양액의 나노입자추적 분석 결과

3.3 듀얼 시린지가 적용된 세포외 소포 분리법

듀얼 시린지펌프의 성능 평가를 위해 시아노박테리아의 일종인 스피루리나 배양액을 사용하였다. 스피루리나 내 세포외 소포 분리 실험에 활용된 필터링 시스템의 P&ID와 실제 여과 공정 사진은 Fig. 10에 나타내었다. [9]

Fig. 10

듀얼 시린지가 적용된 세포외 소포체 분리시스템 P&ID(상단) 및 실제 시스템 사진(하단)

미세 입자 분리 여과법에서는 전처리가 특히 중요하며, 이를 통해 1 μm 이상의 입자를 모두 제거함으로써 깨끗한 배양액을 확보할 수 있다.

본 실험에서는 스피루리나 배양액으로부터 시아노박테리아를 제거하기 위해 직경 0.65 μm의 시린지 필터로 1차 여과를 수행한 뒤, 추가로 0.45 μm의 시린지 필터를 이용한 2차 여과로 잔여 불순물을 제거하였다. 이후 소포체 분리 공정의 핵심 단계인 한외여과(ultrafiltration) 공정을 자체 제작한 300 kDa급 폴리머 멤브레인(PES: Polyethersulfone) 필터를 이용하였으며, 이를 연동펌프 및 듀얼 시린지펌프와 조합하여 단백질 수준의 불순물 제거를 수행하였다. 여과 공정 동안 인산완충생리식염수(Phosphate-Buffered Saline, PBS)를 지속적으로 주입하여 버퍼를 완전히 치환한 후, 최종적으로 300 kDa와 0.45 μm 사이의 크기 범위에 해당하는 스피루리나 세포외 소포를 함유한 용액을 확보하였다.

여과된 스피루리나 세포외 소포 용액은 투과전자현미경(TEM: Transmission Electron Microscopy)을 활용하여 소포체의 표면 상태를 관찰하였다. 각 시료 5 μL는 그리드에 도포한 뒤, 플라즈마 시스템을 통해 글로우 방전을 실시하고 1% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)를 이용한 네거티브 염색을 진행하였다. 염색된 시료는 가속전압 100 kV 조건에서 관찰하였으며, 그 결과 Fig. 11에서처럼 연동펌프로 여과한 시료에서는 소포체 응집 현상이 매우 심각하게 관찰된 반면, 듀얼 시린지펌프를 활용한 여과 시료에서는 응집이 거의 나타나지 않는 것으로 확인되었다. [10]

Fig. 11

연동펌프 사용후 스피루리나 세포외 소포체 투과전자현미경 이미지(왼쪽), 듀얼 시린지펌프 사용 후 이미지(오른쪽)